論文上線截圖

長期應(yīng)激的不良反應(yīng)與神經(jīng)精神疾病的發(fā)病和惡化相關(guān)，慢性應(yīng)激暴露可顯著改變大腦功能，導(dǎo)致焦慮和抑郁等情緒癥狀。除情緒癥狀外，患者還常出現(xiàn)認(rèn)知缺陷等其他癥狀。應(yīng)激相關(guān)癥狀的多樣性對實(shí)現(xiàn)有效且持久的治療提出了挑戰(zhàn)。行為癥狀的多樣性提示，應(yīng)激下的不同表型可能由獨(dú)立的神經(jīng)環(huán)路元件介導(dǎo)。然而，目前尚不清楚不同腦區(qū)如何相互連接或這些環(huán)路如何導(dǎo)致特定的行為領(lǐng)域。因此，明確介導(dǎo)不同應(yīng)激相關(guān)癥狀的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制可能最終促進(jìn)創(chuàng)新治療策略的開發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠基底前腦存在兩個不同的膽堿能亞群，分別投射至背側(cè)海馬（dorsal hippocampus, dHPC）和腹側(cè)海馬（ventral hippocampus, vHPC）。這些亞群在輸入組織、電生理特性、轉(zhuǎn)錄組特征以及對刺激正負(fù)效價的響應(yīng)上均存在顯著差異，并分別主導(dǎo)認(rèn)知與情緒的調(diào)控。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠焦慮水平升高及認(rèn)知功能受損，同時伴隨vHPC膽堿能投射增強(qiáng)和dHPC投射抑制。通過化學(xué)遺傳學(xué)激活dHPC投射或抑制vHPC投射，可有效緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的行為異常。此外，聯(lián)合使用乙酰膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊（donepezil）與vHPC區(qū)M1型毒蕈堿受體阻斷劑，能夠同時逆轉(zhuǎn)應(yīng)激引發(fā)的上述表型。這些數(shù)據(jù)揭示了不同的隔海馬膽堿能環(huán)路在應(yīng)激下獨(dú)立介導(dǎo)特定癥狀的機(jī)制，為基于環(huán)路靶向治療應(yīng)激相關(guān)精神疾病提供了新策略。

1. MS/vDB ChAT神經(jīng)元傳遞負(fù)性效價信號

作者在ChAT-ires-Cre小鼠中通過病毒表達(dá)Cre依賴的GCaMP6m鈣指示劑，并使用置于MS/vDB上方的光纖記錄熒光信號變化（圖1A）。組織學(xué)分析顯示，在鈣成像實(shí)驗(yàn)中，超過90%的GCaMP6m表達(dá)細(xì)胞與MS/vDB中的ChAT陽性細(xì)胞共定位（圖1A）。

作者首先檢測了在厭惡刺激下GCaMP6m熒光強(qiáng)度的變化。電擊后和尾部束縛測試（TRT）中GCaMP6m信號迅速增強(qiáng)（圖1B、C），表明神經(jīng)元對物理刺激的反應(yīng)增強(qiáng)（圖1F、G）。隨后，通過口腔導(dǎo)管向小鼠灌注奎寧溶液（5 mM，10 μl/0.5 s）（圖1H），奎寧給藥顯著增強(qiáng)GCaMP6m熒光強(qiáng)度（圖1H、I）。

通過光遺傳學(xué)激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元，作者研究了其在實(shí)時位置回避（RTPA）中的作用。藍(lán)光刺激可有效激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元（圖2B）。與對照組相比，ChR2表達(dá)動物對刺激室的偏好降低（圖2C），且在刺激側(cè)運(yùn)動活性增加（圖2D）。通過巴甫洛夫條件性位置厭惡實(shí)驗(yàn)評估光激活誘導(dǎo)的長期學(xué)習(xí)關(guān)聯(lián)（圖2E）。這些結(jié)果支持MS/vDB ChAT神經(jīng)元激活編碼負(fù)性效價。

圖1. 厭惡刺激引起MS/vDB ChAT神經(jīng)元活動

圖2. 激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元誘導(dǎo)位置回避

2. MS/vDB ChAT神經(jīng)元處理并調(diào)控焦慮狀態(tài)

上述發(fā)現(xiàn)提示MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性增強(qiáng)可誘發(fā)動物的防御反應(yīng)。為探究其在自發(fā)回避行為中的作用，作者在高架十字迷宮（EPM）中記錄其活性。小鼠進(jìn)入焦慮性開放臂前，MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性升高，并在探索開放臂期間持續(xù)增強(qiáng)（圖3A-C），表明這些神經(jīng)元更傾向于編碼焦慮相關(guān)特征。

僅在開放臂探索時抑制MS/vDB ChAT神經(jīng)元，可顯著延長小鼠在開放臂停留時間（圖3F），而閉合臂抑制無此效應(yīng)（圖3G）。光激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)ChR2組小鼠開放臂探索時間和進(jìn)入次數(shù)減少（圖3I-K），OFT測試中中心探索時間減少（圖3L-M）。這些結(jié)果表明，MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性可作為焦慮狀態(tài)的信號和調(diào)控因子。

圖3. MS/vDB ChAT神經(jīng)元處理和調(diào)節(jié)類焦慮行為

3. MS/vDB ChAT神經(jīng)元存在投射至dHPC和vHPC的獨(dú)特亞群

為了確定投射到dHPC和vHPC的MS/vDB ChAT神經(jīng)元是否為同一實(shí)體或不同實(shí)體，作者將Cre誘導(dǎo)的、逆行運(yùn)輸?shù)牟《据d體分別注射到背側(cè)CA1（dCA1）（AAVretro-Dio-EYFP）和腹側(cè)CA1（vCA1）（AAVretro-Dio-mCherry）中（圖4B）。作者觀察到投射到dCA1和vCA1區(qū)域的神經(jīng)元群體有明顯的，且?guī)缀鯖]有重疊（圖4C）。

作者隨后檢查了這些不同亞群的ChAT神經(jīng)元的輸出區(qū)域（圖4G）。對海馬內(nèi)軸突纖維的分析顯示，投射到dCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元以相似的程度投射到dCA1、背側(cè)齒狀回（dDG）和dCA3，而投射到vCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元主要支配vCA1和vCA3（圖4H）。由于dCA1或vCA1投射的MS/vDB ChAT神經(jīng)元在海馬中的靶點(diǎn)可以分為背側(cè)和腹側(cè)兩組，因此，投射到dCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元將被稱為ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元，投射到vCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元將被稱為ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元。

圖4. 不同亞群的MS/vDB ChAT神經(jīng)元投射到dCA1和vCA1

4. MS/vDB膽堿能輸入分別調(diào)控vHPC和dHPC介導(dǎo)的焦慮樣行為與空間學(xué)習(xí)

作者接下來研究了來自MS/vDB到vHPC的膽堿能纖維的活動（圖5A）。組織學(xué)分析顯示，在MS/vDB中，超過90%的GCaMP6s陽性細(xì)胞與ChAT陽性細(xì)胞共定位（圖5B）。在vHPC區(qū)域上方植入了光纖（圖5C）。來自EPM的記錄數(shù)據(jù)顯示，在小鼠進(jìn)入開放臂之前，MS/vDB-vHPC ChAT纖維迅速激活，并且在小鼠探索開放臂期間這些纖維表現(xiàn)出更高的活動性（圖5D和E）。

結(jié)果表明，在開放臂探索期間，而不是在封閉臂探索期間，選擇性抑制來自MS/vDB-vHPC的膽堿能投射，有效地減輕了EPM中的開放臂回避行為（圖5G和H）。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明，MS/vDB對vHPC區(qū)域的膽堿能輸入通過釋放ACh調(diào)節(jié)焦慮樣行為。同樣的道理，MS/vDB-dHPC的膽堿能投射可以獨(dú)立介導(dǎo)焦慮樣行為和空間學(xué)習(xí)。

圖5. MS/vDB對vHPC和dHPC的膽堿能輸入分別調(diào)節(jié)類焦慮行為和空間學(xué)習(xí)

5. 慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)ChATMS/vDB-dHPC和ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的電生理與轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性差異

作者研究了在病理性應(yīng)激下，ChATMS/vDB-dHPC和ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的活動是否發(fā)生了改變。在應(yīng)激小鼠中，由去極化引起的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的放電活動顯著增加（圖6B）。并證明慢性應(yīng)激損害了ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元的固有興奮性（圖6C和D）?？傮w而言，作者的電生理學(xué)發(fā)現(xiàn)表明，接受慢性應(yīng)激的動物表現(xiàn)出增強(qiáng)的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元活動和降低的ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元活動。慢性應(yīng)激后，在ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元中，8個離子通道基因上調(diào)，5個離子通道基因下調(diào)。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后電生理變化的機(jī)制可能涉及差異表達(dá)的候選離子通道基因。

圖6. ChATMS/vDB-dHPC與ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元對慢性束縛應(yīng)激表現(xiàn)出差異化的電生理及轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性

6. 調(diào)控特定隔海馬膽堿能環(huán)路可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激誘導(dǎo)的癥狀

為了進(jìn)一步研究慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的過度活躍和ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元的遲緩是否分別導(dǎo)致焦慮水平升高和認(rèn)知功能障礙，作者通過化學(xué)遺傳學(xué)手段拮抗這兩條通路中的變化?；瘜W(xué)遺傳學(xué)激活MS/vDB-dHPC膽堿能投射緩解了在Morris水迷宮（MWM）中觀察到的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的下降（圖7C至F）。另一方面，通過hM4Di抑制MS/vDB-vHPC膽堿能投射逆轉(zhuǎn)了應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為（圖7G至K）。這些數(shù)據(jù)表明，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的不同隔海馬膽堿能回路的異?；顒涌赡芊謩e調(diào)節(jié)情緒和認(rèn)知障礙。

圖7. 操縱不同的中隔-海馬膽堿能通路可以挽救由慢性壓力引起的記憶缺陷和焦慮樣行為

7. AChEIs聯(lián)合阻斷M1可改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知缺陷和焦慮樣行為

作者接下來研究了是否可以通過靶向基于回路的膽堿能信號通路來挽救應(yīng)激誘導(dǎo)的行為缺陷。通過全細(xì)胞膜片鉗記錄檢查M1和M3受體對這兩種投射介導(dǎo)的突觸傳遞的作用（圖8A和C）。光誘導(dǎo)的ACh釋放引發(fā)了dCA1和vCA1錐體細(xì)胞中的煙堿型內(nèi)向電流和毒蕈堿型內(nèi)向電流（圖8B和D）。在vCA1區(qū)域，M1受體拮抗劑（M1i）而非M3受體拮抗劑（M3i）抑制了光誘導(dǎo)的毒蕈堿型內(nèi)向電流（圖8B）。在dCA1區(qū)域，毒蕈堿型內(nèi)向電流可以被M3i或M1i抑制（圖8D）。這些觀察結(jié)果表明，M1受體對于MS/vDB-vHPC膽堿能通路至關(guān)重要，而dCA1膽堿能投射的突觸后興奮性效應(yīng)由M1和M3受體共同介導(dǎo)。

接下來，作者研究了多奈哌齊和M1i的聯(lián)合應(yīng)用是否可以改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知和情緒障礙（圖8E）。在EPM測試中，作者觀察到多奈哌齊的給藥加劇了應(yīng)激小鼠的焦慮狀態(tài)。然而，單獨(dú)或與多奈哌齊聯(lián)合將M1i注入vHPC區(qū)域，有效地改善了應(yīng)激小鼠的焦慮樣行為（圖8F和G）。在Morris水迷宮（MWM）測試中，單獨(dú)或與M1i聯(lián)合給藥多奈哌齊改善了應(yīng)激誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙；然而，在接受M1i注入vHPC區(qū)域的應(yīng)激組中未觀察到改善（圖8H至K）。因此，這些結(jié)果表明，多奈哌齊和M1的聯(lián)合給藥可以有效地逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的情緒和認(rèn)知缺陷。

圖8. 乙酰膽堿酯酶聯(lián)合阻斷M1受體可改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知缺陷和焦慮樣行為

結(jié)論

通過靶向膽堿能信號通路，作者可以改善應(yīng)激誘導(dǎo)的情緒和認(rèn)知障礙。這些發(fā)現(xiàn)可能為開發(fā)針對應(yīng)激相關(guān)障礙的特定回路的治療方法提供見解。此外，對膽堿能回路的侵入性調(diào)節(jié)需要進(jìn)一步研究如何通過藥物靶向dHPC和vHPC中不同的ACh受體，以治療應(yīng)激相關(guān)的情緒和認(rèn)知缺陷。

MORRIS水迷宮

Morris水迷宮（ MWM）實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動物（大鼠、小鼠）游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實(shí)驗(yàn)，主要用于測試實(shí)驗(yàn)動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力。